运输方式
液氮运输
1、吸附式液氮运输，无游离液氮，冒白烟即说明正常。
2、温度监测设备严密监控运输过程中的罐内温度，如发现异常可拷贝温度记录仪上的PDF和excel数据（温度监测设备一头可拔掉，显示USB接头，插入电脑即可拷贝数据，如遇到困难，可联系销售人员和技术支持解决）。
3、合金密码锁，保证从发出到收货，没有第三方可以打开液氮罐接触细胞，保护细胞安全。
4、GPS定位器，细胞运输轨迹全程掌握，防止丢件。
5、液氮罐、温度监测设备、合金密码锁、GPS定位器为回收部件，请妥善保管，禁止破坏，否则会被拉入黑名单。
文章引用
略
适用范围
1、肝脏基础研究，包括肝炎病毒（HBV/HCV）、新药研发、病毒感染、基因表达调控。
2、药物开发：药物药效、药物毒性、药物代谢、药物相互作用。
基因操作方法
1、慢病毒，MOI=30-50可达到接近100%感染效率，需提前测试；
2、AAV，MOI=10^5可达到80%以上感染效率，需提前测试；
3、ASGPR-GalNac自由摄取，小核酸需提前修饰GalNac，可达到80%以上递送效率；
4、不推荐Lipo2000/3000，原代肝细胞转染毒性大、效率低，除非已经测试没有问题。
由于我司产品说明书半年更新一次，以下步骤仅作参考，以公司随货说明书为准
II 试剂与材料
Ø 树鼩原代肝细胞（Cat# LV-PTH001）
Ø 复苏培养基（贴壁肝细胞需要，Cat#LV-Rec001）
Ø 纯化培养基（如需要，随细胞赠送）
Ø 铺板培养基（贴壁肝细胞需要，Cat#LV-WEP003）
Ø 维持培养基（贴壁肝细胞需要，Cat#LV-WEM003）
Ø 胶原包被培养板（贴壁肝细胞需要，Cat#LV-Coated）
Ø William's Medium E（WE）培养基（悬浮肝细胞需要，客户自备）
Ø 非TC处理板（悬浮肝细胞需要，客户自备）
Ø 无菌15mL离心管
Ø 宽口移液枪头（普通移液枪头剪去尖头，再灭菌使用）
Ø 移液枪
Ø 恒温水浴锅（37℃预热，请用温度计校准）
Ø 冷冻水平离心机（带水平转子，可离心15mL离心管）
Ø 生物安全柜
Ø 37oC/5%CO2培养箱
重要提示：解冻时，冻存细胞转移必须使用液氮转移；在整个复苏实验过程中必须全程使用宽口枪头。
IV 贴壁细胞的复苏与铺板
1. 在生物安全柜中，将10mL复苏培养基（Cat#LV-Rec001）加入到15mL离心管中，37℃恒温水浴锅预热20分钟，然后转移到生物安全柜中；纯化培养基冰浴或4℃放置待用（如需要）；铺板培养基37℃预热。
2. 将冻存的肝细胞从液氮中迅速转移至37℃恒温水浴锅中。将冻存管尽可能多的浸入水中（冻存管管盖保持在液面以上），于水中顺时针大范围划圈。
3. 解冻冻存管约90-120s，至冻存管中只有小块碎冰漂浮即可。
4. 用75%酒精消毒冻存管，并将其转移到生物安全柜。
5. 用宽口枪头将细胞吸出，并以滴加方式转移至10mL预热的复苏培养基中（注意：冻存管与枪头上残留细胞，可吸取1mL复苏培养基润洗冻存管与枪头并将其混入离心管的培养基中），轻微上下颠倒2-3次混匀。
6. 得到的细胞悬液使用50g，常温离心5分钟。去上清，用铺板培养基重悬，用台盼蓝排除法（V细胞悬液：V0.4%台盼蓝=9：1，细胞活率使用血球计数板手工计数，勿用细胞计数仪；细胞总数使用细胞计数仪计数）测定肝细胞的活力、细胞总数，建议细胞总数检测3次，求取平均值；为节约时间，细胞活率检测1次。
7. 如细胞活力大于70%，按照活细胞数1.5-1.8×105cells/cm2铺板到胶原包被培养板，摇匀，置37oC/5%CO2培养箱中培养16小时。
如细胞活力小于70%，进行细胞纯化：将细胞悬液离心，100g，常温离心5分钟，去上清，用2mL纯化培养基（免费提供）重悬细胞，然后沿管壁向离心管小心加入1mL铺板培养基（切勿扰动下层，加入后可见明显分层）；800g，4℃离心10分钟（升速为9，降速为1）离心后，吸取纯化培养基和铺板培养基之间的浑浊带（活细胞层），转移到新的15mL离心管中；加入2倍体积的铺板培养基，混匀后，50g，常温离心5分钟；去上清，用4mL铺板培养基重悬细胞。后续细胞计数及铺板同第6，7步骤。
v 重要提示：为了达到理想的铺板效果，在细胞铺板时必须确保均匀，不能出现细胞聚集情况（肉眼可判断是否不均匀），否则细胞在聚集区密度过高导致不易贴壁；建议1：将细胞悬液混匀后，再加入到培养孔中，无需摇匀，在安全柜中静置10分钟，确保细胞沉降并黏附在板底（肉眼观察是否有堆积情况），然后再小心转移至培养箱中；建议2：在铺板96孔和48孔板时，由于孔板的边缘表面张力，导致“U”型液面，可将培养体系的培养基体积增加到1.5-2倍，无需摇匀，在安全柜中静置10分钟，确保细胞沉降并黏附在板底，然后再小心转移至培养箱中，防止细胞在边缘堆积，造成细胞贴壁出现边缘多中间少的情况。
V 肝细胞维持及乙型肝炎病毒感染
1. 铺板培养16小时后，细胞已经完全贴壁，移除铺板培养基（含部分死细胞），加入维持培养基，每2天换液1次（注意：如想培养体系更干净，可用WE培养基清洗，切勿使用PBS清洗细胞）。。
2. 制备感染培养液：维持培养基中预先加入HBV病毒（HepAD38 MOI=500~1000, 纯化病人血清 MOI=100~500，更高的MOI可能进一步提高感染效率）。
3. 移除旧培养液，加入感染培养液，在37℃ / 5% CO2培养箱中培养16小时或过夜。
4. 移除感染培养液，用维持培养基清洗3次，再加入维持培养基，在37℃/ 5% CO2培养箱中继续培养。
5. HBV感染后每2天收上清1次，用于病毒抗原及HBV DNA检测，收集3dpi、5dpi、7dpi、9dpi上清，9dpi可结束细胞培养，更长的培养时间取决于细胞状态 (dpi: 感染后培养天数)。
细胞复苏后不可再冻存
VI 关于售后
如您发现产品有任何质量问题，请您收集原始数据，并第一时间联系公司销售或者技术支持，公司安排人员保证售后。每个实验室条件不同，操作人员习惯不同，熟练程度不一样，实验失败存在客观因素。如未严格按照说明书操作、超过售后时限，公司不做售后，请老师理解与支持。
售后有效期与提供的原始数据：
复苏问题：立刻报告异常；提供台盼蓝染色或者AO/PI染色。
污染问题：复苏96小时以内；提供相差显微镜照片。
纯度问题：一个月内；提供免疫荧光或者流式结果。
VII 联系电话
公司电话：0755-28284050
技术支持：19902901483（周博士）
