运输方式
液氮运输
1、吸附式液氮运输，无游离液氮，冒白烟即说明正常。
2、温度监测设备严密监控运输过程中的罐内温度，如发现异常可拷贝温度记录仪上的PDF和excel数据（温度监测设备一头可拔掉，显示USB接头，插入电脑即可拷贝数据，如遇到困难，可联系销售人员和技术支持解决）。
3、合金密码锁，保证从发出到收货，没有第三方可以打开液氮罐接触细胞，保护细胞安全。
4、GPS定位器，细胞运输轨迹全程掌握，防止丢件。
5、液氮罐、温度监测设备、合金密码锁、GPS定位器为回收部件，请妥善保管，禁止破坏，否则会被拉入黑名单。
文章引用
1、CHEN Yi, TANG Dan, WU Hongping, et al. Assessment of long-term functional maintenance of primary human hepatocytes to predict drug-induced hepatoxicity in vitro[J]. Archives of Toxicology, 2021, 95(6): 1-26. DOI: 10.1007/s00204-021-03050-y.
2、Youquan Zhong # 1 2, Chuanjian Wu # 1, Zaichao Xu 1, Yan Teng 1, Li Zhao 1, Kaitao Zhao 1, Jingjing Wang 1, Wen Wang 3, Qiong Zhan 1, Chengliang Zhu 4, Xinwen Chen 5, Kaiwei Liang 3, Xiaoming Cheng 1 6 7, Yuchen Xia 1Hepatitis B Virus Core Protein Is Not Required for Covalently Closed Circular DNA Transcriptional Regulation. J Virol. 2022 Nov 9;96(21):e0136222. doi: 10.1128/jvi.01362-22. Epub 2022 Oct 13.
3、Lin Xu 1, Qianwen Zhao 1, Jiao Luo 1, Wanli Ma 1, Yuan Jin 1, Chuanhai Li 1, Yufei Hou 1, Meiyao Feng 1, Ying Wang 1, Jing Chen 1, Jinquan Zhao 1, Yuxin Zheng 2, Dianke Yu 3. Integration of proteomics, lipidomics, and metabolomics reveals novel metabolic mechanisms underlying N, N-dimethylformamide induced hepatotoxicity. Ecotoxicol Environ Saf. 2020 Dec 1:205:111166. doi: 10.1016/j.ecoenv.2020.111166. Epub 2020 Aug 19.
适用范围
1、肝脏基础研究，包括基础肝脏疾病研究、病毒感染、基因表达调控。
2、药物开发：药物药效、药物毒性、药物代谢、药物相互作用。
基因操作方法
1、慢病毒，MOI=30-50可达到接近100%感染效率，需提前测试；
2、AAV，MOI=10^5可达到80%以上感染效率，需提前测试；
3、ASGPR-GalNac自由摄取，小核酸需提前修饰GalNac，可达到80%以上递送效率；
4、不推荐Lipo2000/3000，原代肝细胞转染毒性大、效率低，除非已经测试没有问题。
由于我司产品说明书半年更新一次，以下步骤仅作参考，以公司随货说明书为准
II 试剂与材料
Ø 人原代肝细胞（Cat# LV-PHH001/2）
Ø 复苏培养基（贴壁肝细胞需要，Cat#LV-Rec001）
Ø 纯化培养基（如需要，随细胞赠送）
Ø 铺板培养基（贴壁肝细胞需要，Cat#LV-WEP001）
Ø 维持培养基（贴壁肝细胞需要，Cat#LV-WEM001）
Ø 胶原包被培养板（贴壁肝细胞需要，Cat#LV-Coated）
Ø William's Medium E（WE）培养基（悬浮肝细胞需要，客户自备）
Ø 非TC处理板（悬浮肝细胞需要，客户自备）
Ø 无菌15mL离心管
Ø 一次性移液管
Ø 宽口移液枪头（普通移液枪头剪去尖头，再灭菌使用）
Ø 移液枪
Ø 恒温水浴锅（37℃预热，请用温度计校准）
Ø 冷冻水平离心机（带水平转子，可离心15mL离心管）
Ø 生物安全柜
Ø 37oC/5%CO2培养箱
重要提示：解冻时，冻存细胞转移必须使用液氮转移；在整个复苏实验过程中必须全程使用宽口枪头。
IV 贴壁细胞的复苏与铺板
在生物安全柜中，将10mL复苏培养基（Cat#LV-Rec001）加入到15mL离心管中，37℃恒温水浴锅预热20分钟，然后转移到生物安全柜中；
1. 纯化培养基冰浴或4℃放置待用（如需要）；铺板培养基37℃预热。
2. 将冻存的肝细胞从液氮中迅速转移至37℃恒温水浴锅中。将冻存管尽可能多的浸入水中（冻存管管盖保持在液面以上），于水中顺时针大范围划圈。
3. 解冻冻存管约90-120s，至冻存管中只有小块碎冰漂浮即可。
4. 用75%酒精消毒冻存管，并将其转移到生物安全柜。
5. 用宽口枪头将细胞吸出，并以滴加方式转移至10mL预热的复苏培养基中（注意：冻存管与枪头上残留细胞，可吸取1mL复苏培养基润洗冻存管与枪头并将其混入离心管的培养基中），轻微上下颠倒2-3次混匀。
6. 得到的细胞悬液使用50g，常温离心5分钟。去上清，用铺板培养基重悬，用台盼蓝排除法（V细胞悬液：V0.4%台盼蓝=9：1，细胞活率使用血球计数板手工计数，勿用细胞计数仪；细胞总数使用细胞计数仪计数）测定肝细胞的活力、细胞总数，建议细胞总数检测3次，求取平均值；为节约时间，细胞活率检测1次。
7. 如细胞活力大于70%，按照活细胞数1.2-1.5×105cells/cm2铺板到胶原包被培养板，摇匀，置37oC/5%CO2培养箱中培养16小时。
8. 如细胞活力小于70%，进行细胞纯化：将细胞悬液离心，100g，常温离心5分钟，去上清，用2mL纯化培养基（免费提供）重悬细胞，然后沿管壁向离心管小心加入1mL铺板培养基（切勿扰动下层，加入后可见明显分层）；800g，4℃离心10分钟（升速为9，降速为1）离心后，吸取纯化培养基和铺板培养基之间的浑浊带（活细胞层），转移到新的15mL离心管中；加入2倍体积的铺板培养基，混匀后，50g，常温离心5分钟；去上清，用4mL铺板培养基重悬细胞。后续细胞计数及铺板同第6，7步骤。
❖重要提示：为了达到理想的铺板效果，在细胞铺板时必须确保均匀，不能出现细胞聚集情况（肉眼可判断是否不均匀），否则细胞在聚集区密度过高导致不易贴壁；建议1：将细胞悬液混匀后，再加入到培养孔中，无需摇匀，在安全柜中静置10分钟，确保细胞沉降并黏附在板底（肉眼观察是否有堆积情况），然后再小心转移至培养箱中；建议2：在铺板96孔和48孔板时，由于孔板的边缘表面张力，导致“U”型液面，可将培养体系的培养基体积增加到1.5-2倍，无需摇匀，在安全柜中静置10分钟，确保细胞沉降并黏附在板底，然后再小心转移至培养箱中，防止细胞在边缘堆积，造成细胞贴壁出现边缘多中间少的情况。
V 肝细胞维持及乙型肝炎病毒感染
1. 铺板培养16小时后，细胞已经完全贴壁，移除铺板培养基（含部分死细胞），加入维持培养基，每2天换液1次（注意：如想培养体系更干净，可用WE培养基清洗，切勿使用PBS清洗细胞）。
2. 制备感染培养液：维持培养基中预先加入4%PEG8000并混匀，HBV病毒（HepAD38 MOI=500~1000, 纯化病人血清 MOI=100~500，更高的MOI可能进一步提高感染效率）。
3. 移除旧培养液，加入感染培养液，在37℃/5% CO2培养箱中培养16小时或过夜。
4. 移除感染培养液后，用维持培养基清洗3次，再加入维持培养基，在37℃/5%CO2培养箱中继续培养。
5. HBV感染后每2天收上清1次，用于病毒抗原及HBV DNA检测，收集3dpi、5dpi、7dpi、9dpi上清，9dpi可结束细胞培养，更长的培养时间取决于细胞状态 (dpi: 感染后培养天数)。
细胞复苏后不可再冻存
VI 关于售后
如您发现产品有任何质量问题，请您收集原始数据，并第一时间联系公司销售或者技术支持，公司安排人员保证售后。每个实验室条件不同，操作人员习惯不同，熟练程度不一样，实验失败存在客观因素。如未严格按照说明书操作、超过售后时限，公司不做售后，请老师理解与支持。
售后有效期与提供的原始数据：
复苏问题：立刻报告异常；提供台盼蓝染色或者AO/PI染色。
污染问题：复苏96小时以内；提供相差显微镜照片。
纯度问题：一个月内；提供免疫荧光或者流式结果。
VII 联系电话
公司电话：0755-28284050
技术支持：19902901483（周博士）
