Transport Mode
Liquid Nitrogen Transportation
1、Adsorptive Liquid Nitrogen Transportation ,No free liquid nitrogen ,White vapor emission indicates normal operation.
2、Temperature monitoring devices should closely monitor the temperature inside the tank during transportation. If any abnormalities are detected, you can copy the PDF and Excel data from the temperature recorder. (One end of the temperature monitoring device can be unplugged to reveal a USB connector. Simply insert it into a computer to copy the data. If you encounter any difficulties, you can contact the sales staff and technical support for assistance.)
3、Alloy Combination Lock Designed to ensure no third-party access to the LN₂ tank or cell samples during transportation from dispatch to receipt, thereby safeguarding cell integrity.
4、GPS Tracker Enables real-time tracking of cell transportation routes to prevent loss.
5、Liquid Nitrogen Tank, temperature monitoring device, alloy combination lock, and GPS tracker are returnable components. Please store them properly and avoid damage; failure to comply will result in blacklisting.
Reference Citation
blush.
Scope of Application
1、Basic Liver Research Encompassing fundamental studies on liver diseases, viral infections, and gene expression regulation.
2、Drug Development: Encompassing studies on drug efficacy, toxicity, metabolism, and drug-drug interactions.
Gene Manipulation Methods
1、Lentivirus MOI=30-50 achieves near 100% infection efficiency (requires pre-testing).
2、Adeno-Associated Virus (AAV) MOI=1×10⁵ achieves ≥80% infection efficiency (requires pre-testing).
3、ASGPR-mediated uptake of GalNAc-conjugated small nucleic acids can achieve delivery efficiencies exceeding 80% (pre-modification with GalNAc is required).
4、Lipofectamine® 2000/3000 is not recommended for primary hepatocyte transfection due to high cytotoxicity and low efficiency unless rigorously validated under user-specific experimental conditions.
由于我司产品说明书半年更新一次，以下步骤仅作参考，以公司随货说明书为准
II 试剂与材料
Ø 小鼠原代肝细胞（Cat# LV-PMH001/2）
Ø 复苏培养基（Cat#LV-Rec001）
Ø 纯化培养基（如需要，随细胞赠送）
Ø 铺板培养基（贴壁肝细胞需要，Cat#LV-WEP006）
Ø 维持培养基（贴壁肝细胞需要，Cat#LV-WEM006）
Ø 胶原包被培养板（贴壁肝细胞需要，Cat#LV-Coated）
Ø William's Medium E（WE）培养基（悬浮肝细胞需要，客户自备）
Ø 非TC处理板（悬浮肝细胞需要，客户自备）
Ø 无菌15ml离心管
Ø 宽口移液枪头（普通移液枪头剪去尖头，再灭菌使用）
Ø 移液枪
Ø 恒温水浴锅（37℃预热，请用温度计校准）
Ø 冷冻水平离心机（带水平转子，可离心15ml离心管）
Ø 生物安全柜
Ø 37oC/5%CO2培养箱
Ø 75% 酒精
重要提示：解冻时，冻存细胞转移必须使用液氮转移；在整个复苏实验过程中必须全程使用宽口枪头。
IV 贴壁细胞的复苏与铺板
1. 在生物安全柜中，将10mL复苏培养基（Cat#LV-Rec001）加入到15mL离心管中，37℃恒温水浴锅预热20分钟，然后转移到生物安全柜中；纯化培养基冰浴或4℃放置待用（如需要）；铺板培养基37℃预热。
2. 将冻存的肝细胞从液氮中迅速转移至37℃恒温水浴锅中。将冻存管尽可能多的浸入水中（冻存管管盖保持在液面以上），于水中顺时针大范围划圈。
3. 解冻冻存管约90-120s，至冻存管中只有小块碎冰漂浮即可。
4. 用75%酒精消毒冻存管，并将其转移到生物安全柜。
5. 用宽口枪头将细胞吸出，并以滴加方式转移至10mL预热的复苏培养基中（注意：冻存管与枪头上残留细胞，可吸取1mL复苏培养基润洗冻存管与枪头并将其混入离心管的培养基中），轻微上下颠倒2-3次混匀。
6. 得到的细胞悬液使用50g，常温离心5分钟。去上清，用铺板培养基重悬，用台盼蓝排除法（V细胞悬液：V0.4%台盼蓝=9：1，细胞活率使用血球计数板手工计数，勿用细胞计数仪；细胞总数使用细胞计数仪计数）测定肝细胞的活力、细胞总数，建议细胞总数检测3次，求取平均值；为节约时间，细胞活率检测1次。
7. 如细胞活力大于70%，按照活细胞数0.8-1.0×105cells/cm2铺板到胶原包被培养板，摇匀，置37oC/5%CO2培养箱中培养16小时。
如细胞活力小于70%，进行细胞纯化：将细胞悬液离心，100g，常温离心5分钟，去上清，用2mL纯化培养基（免费提供）重悬细胞，然后沿管壁向离心管小心加入1mL铺板培养基（切勿扰动下层，加入后可见明显分层）；800g，4℃离心10分钟（升速为9，降速为1）离心后，吸取纯化培养基和铺板培养基之间的浑浊带（活细胞层），转移到新的15mL离心管中；加入2倍体积的铺板培养基，混匀后，50g，常温离心5分钟；去上清，用4mL铺板培养基重悬细胞。后续细胞计数及铺板同第6，7步骤。
v 重要提示：为了达到理想的铺板效果，在细胞铺板时必须确保均匀，不能出现细胞聚集情况（肉眼可判断是否不均匀），否则细胞在聚集区密度过高导致不易贴壁；建议1：将细胞悬液混匀后，再加入到培养孔中，无需摇匀，在安全柜中静置10分钟，确保细胞沉降并黏附在板底（肉眼观察是否有堆积情况），然后再小心转移至培养箱中；建议2：在铺板96孔和48孔板时，由于孔板的边缘表面张力，导致“U”型液面，可将培养体系的培养基体积增加到1.5-2倍，无需摇匀，在安全柜中静置10分钟，确保细胞沉降并黏附在板底，然后再小心转移至培养箱中，防止细胞在边缘堆积，造成细胞贴壁出现边缘多中间少的情况。
V 肝细胞维持培养
1. 铺板培养4-6小时后，细胞已经完全贴壁，移除铺板培养基（含部分死细胞），加入维持培养基，每2天换液1次。
2. 小鼠原代肝细胞具有有限的增殖能力，具有明显的接触抑制特性，且肝细胞的分化特性及其培养时间依赖于高密度的细胞培养。
3.小鼠原代肝细胞体外维持时间相对较短，建议实验在铺板后3天内完成，最长不超过5天，不建议对小鼠肝细胞进行传代培养。
Cells should not be re-cryopreserved after thawing.
VI Regarding After-Sales Service
Quality Assurance & After-Sales Policy In the event of product quality issues, please: Collect original data Contact our sales representatives or technical support team immediately We will dispatch personnel to address the issue promptly.
After-Sales Validity Period & Submitted Original Data：
Resuscitation issues: Report any abnormalities immediately and provide results of Trypan blue staining or AO/PI staining.
Contamination issues: Report within 96 hours after resuscitation and provide phase-contrast microscope photos.
Purity issues: Report within one month of detection and provide immunofluorescence or flow cytometry results.
VII Contact Number
Company Telephone：0755-28284050
Technical Support：19902901483（ Dr. Zhou）
